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小鼠原代海马神经元细胞的分离培养方法
点击次数:2157 发布日期:2019-8-9  来源:北京百欧博伟生物技术有限公司
原代小知识——小鼠原代海马神经元细胞的分离培养方法
 
海马体主要负责记忆和学习,日常生活中的短期记忆都储存在海马体中。神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元具有长突起,由细胞体和细胞突起构成。
小鼠海马神经元细胞的组织来源于实验小鼠的正常脑组织,因为海马神经元细胞类似于干细胞属于高分度分化的细胞特性,具有不能传代,不能增殖等特点,所有收到细胞后尽快使用。
 
为了更好的服务于广大科研工作者,技术人员特提供了海马神经元细胞分离培养方法,技术因人而异仅供参考:
1.试验所需仪器设备及试剂
(1)仪器
生物安全柜
CO2细胞培养箱
荧光倒置显微镜
高速冷冻离心机
电热恒温鼓风干燥箱
(2)试剂耗材
T25细胞培养瓶
血球计数板
细胞培养孔板
红细胞裂解液
神经元完全培养基
0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)
多聚甲醛(PFA)
DAPI
Triton X-100
山羊血清
NSE
Goat anti-Rabbit lgG(H+L)
Cross-Adsorbed Secondary antibody,Alexa Fluor 594
Fluoromount-G荧光封片剂
2.分离培养方法
1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡,
2) 在冰浴的PBS中分离海马,PBS洗涤3次,剪碎,
3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型胶原酶37℃水浴振荡消化30min,
4) 用FBS终止消化,轻轻吹打,
5) 过100 μm 滤网,
6) 收集滤液,300 g离心5 min,
7) 用完全培养基重悬沉淀,铺瓶。
3.免疫荧光
3.1.实验步骤
(1)细胞爬片
取3片玻璃片于24孔板中,每孔加入培养基1mL,加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。
(2)固定
细胞爬片后,吸出培养基,用PBS洗1遍,加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS,放4℃过夜。
(3)破膜封闭
将玻片除去水分,置于培养皿支撑物上,
玻璃片封闭液配置:0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合,再加10% 血清,
取50uL破膜封闭液滴于防水膜上,将玻片上有细胞的一面盖上2h。
(4)一抗孵育
一抗配制:抗体与PBS 1:100(200)稀释
破膜封闭后,取50uL一抗于防水膜上(湿盒中),将玻片(有细胞的一面)盖上置于4℃(最多可放置一周)
(5)二抗孵育
室温避光孵育二抗(二抗:PBS=1:500)2h后,PBS洗3×5min/次,染DAPI(DAPI:PBS=1:1000)5min,PBS洗3×5min/次。
(6)包埋
玻片上各滴1滴Fluoromount-G,将有细胞的一面盖上。
鉴定细胞为P1代细胞
3.2.检测结果
(1)细胞免疫荧光鉴定照片
阴性
 
100X-DAPI
NSE
 
100X-DAPI
(2)检验基本情况:
经免疫荧光鉴定,该细胞纯度达到90%以上。
除了上述的细胞分离方法以外,还有很多关于其他细胞的分离方法,想要学习的小伙伴可以来进行现场学习,如果想要其他原代分离培养方法,可打电话或咨询相关技术人员哦。
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