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Cell主刊:高内涵筛选助力攻克毒性蛋白质病难题
点击次数:1044 发布日期:2019-9-19  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

 
毒性蛋白质病(Proteinopathy)通常由细胞内或细胞外沉积大量折叠变异的蛋白质(Misfolded protein)所致。在蛋白合成和成熟过程中的任何一个环节出现问题,如蛋白突变、折叠以及翻译后修饰出现异常都有可能会导致蛋白质病的发生。虽然蛋白质病这个术语对很多人来说还比较陌生,但现已证明其和多种严重的神经性疾病,如阿尔兹海默症、帕金森病和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的发生密切相关。靶向蛋白质病的研究也为屡屡受挫的神经退行性疾病治疗提供了新的曙光[1,2]
 
高内涵整体解决方案的优异体现
 
在七月的Cell主刊中,研究将目光转至由MUC1基因移码突变导致的肾病(MUC1 kidney disease ,MKD)[3]。与神经性退行性疾病类似,MKD目前尚无有效治疗手段。结合细胞系、小鼠模型、病人组织和日益火热的类器官来源样本,研究证实MUC1突变蛋白(MUC1-fs)会大量聚集在细胞内,并最终激活未折叠蛋白应答(Unfolded protein response UPR),诱发细胞损伤和毒性。因此,MKD也属于蛋白质病的一种。针对该发病机制,研究实施基于高内涵平台的高通量筛选,并成功获得能特异清除突变MUC1蛋白的小分子药物BRD4780。该研究不仅深入我们对蛋白转运异常发生机制的了解,也为多种毒性蛋白质病提供了新的治疗策略和切入点。在七月的研究热点版块中,Nature Review Drug Discovery专门针对发现进行了解析[4]
 
该研究也体现了珀金埃尔默高内涵整体解决方案的高效应用。成像平台Opera Phenix配合CellCarrier Ultra系列微孔板主导高内涵筛选的同时,并通过水镜优势参与了基于上述四种样本的所有荧光拍摄和动态追踪分析细胞凋亡进程。针对类器官样本的拍摄,PreciScan功能被用于提速拍摄进程和排除不需要的图像采集和分析。所有的荧光分析由Harmony软件完成,尤其是‘spot’分析功能的应用。
 

 
a疾病解析
 
通过MKD病人和体外模型等样本,研究使用抗体染色方式分析野生型MUC1和对应突变产物的组织和细胞分布。在不同来源的样本中,值得一提的是基于病人诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells , iPS cells)建立的类器官(Organoid)样本。基于干细胞技术的类器官模型建立和分析也是近年来高内涵的优势应用方向之一[5]与病人的切片结果一致,野生型MUC1主要分布在类器官的顶膜部位,而突变蛋白则分布在细胞内。进一步研究证明聚集在细胞内的突变MUC1会诱发细胞应激,活化ATF6-UPR通路并最终导致细胞损伤,表明MKD是蛋白质病。
 

基于MKD病人的肾类器官模型染色,图片由Opera Phenix拍摄。
红色指示野生型MUC1蛋白;绿色指示突变体MUC1蛋白;蓝色为E-cadherin;黄色为Na/K ATPase标记基底外侧膜。
 
b高内涵筛选
 
为了发现能有效清除突变蛋白的药物,研究针对病人样本建立永生化细胞系,并利用Opera Phenix开展大规模、多指标高内涵筛选。在初筛中,研究关注能清除突变蛋白并无显著细胞毒性的药物,并在此基础上细化筛选药物浓度开展二轮筛选。通过两轮筛选后,研究通过特异性、mRNA水平调控和是否能抑制ER应激药物thapsigargin的细胞毒性三个指标来进一步分析候选药物。
 

高内涵筛选流程图
 
最终,从3713种化合物中,研究成功发现BRD4780满足上述的指标,能有效特异清除突变蛋白的同时不影响MUC1转录水平,并能保护病人模型细胞系不受thapsigargin的应激压力。进一步的实验证明BRD4780能工作于类器官模型和小鼠模型,是非常有潜力的MKD治疗药物。
 

左图:基于细胞系的染色结果,黄色指示野生型MUC1蛋白;绿色指示突变体MUC1蛋白;灰色指示细胞核。
右图:对应的统计分析和细胞数变化分析。
 
c机制研究
 
为了解析MUC1突变体亚细胞聚集原理和BRD4780工作机制,研究利用成像技术进行大量共定位研究,并发现病人来源细胞系中MUC1突变体滞留在内质网和高尔基体之间的早期分泌通路中,并与运货受体TMED9有显著的共定位趋势,且这个现象能进一步在多种模型和病人组织中重现。通过动态成像追踪,研究证明BRD4780能将滞留的突变蛋白从早期分泌途径中释放出来,并促进其进入溶酶体降解途径。
 

基于细胞系的亚细胞共定位研究,分析基于Harmony软件的‘spot’ 分析功能。
 

基于细胞系、小鼠模型、病人组织和类器官来源样本的荧光染色分析,红色指示TMED9;绿色指示突变体MUC1蛋白;灰色指示细胞核。
* 荧光图片均由Opera phenix 拍摄。
 
非常有意思的是,在病人样本中研究同时也发现TMED9蛋白水平的上升,而BRD4780处理同样能降低TMED9蛋白水平。此外,通过CRISPR技术敲除TMED9能表型模拟BRD4780的处理效果,清除突变蛋白。因此,TMED9参与了MUC1突变体在早期分泌途径的滞留和积累,并可能是BRD4780的直接作用靶点。针对此,研究采取细胞热移位测定法(Cellular thermal shift assay,CETSA)证实细胞内BRD4708和TMED9存在直接相互作用。凭借其能在生理条件下进行细胞水平分析的优势,CETSA成为了内源蛋白-药物相互作用分析技术的生力军,是表性筛选下游药物解析的利器。
 

基于CETSA方法在细胞水平确认BRD4708能直接结合TMED9
 
综合上述的发现,研究向我们阐释了MKD的发病以及BRD4780的作用机制。通过直接结合TMED9,BRD4780将突变的MUC1蛋白从内质网和高尔基体之间的早期分泌通路中释放出来,加速溶酶体对其的清除。令人兴奋的是,在具有很好的药理性质的同时,BRD4780不仅能作用于MKD,还能作用于其他多种膜相关蛋白导致的毒性蛋白质病,如UMOD突变相关的慢性肾病和色素性视网膜炎等,是非常有潜力的候选药物。
 

MKD的发病机制和BRD4780的作用机制图
 
同时,该研究也是高内涵两大应用领域的精华案例。首先是亚细胞水平成像应用,研究中涉及到的大量定位、共定位研究和动态追踪蛋白转运过程都是高内涵的优势应用场景。其次,更为关键的是,该研究也是成像筛选主导的药物发现案例。从疾病模型表型的建立到靶向逆转疾病相关表型的筛选,和最后下游的药物机制研究,都离不开珀金埃尔默高内涵解决方案。高内涵解决方案,伴随着机器学习的逐渐成熟,将成为创新药物研发行业的新鲜血液[6]
 
参考文献
 
1. Ganguly G, et al.Proteinopathy, oxidative stress and mitochondrial dysfunction: cross talk in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Drug Des Devel Ther. 2017 Mar 16;11:797-810.
2. Scotter EL, et al.TDP-43 Proteinopathy and ALS: Insights into Disease Mechanisms and Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 2015 Apr;12(2):352-63. doi: 10.1007/s13311-015-0338-x.
3. Dvela-Levitt M, et al.Small Molecule Targets TMED9 and Promotes Lysosomal Degradation to Reverse Proteinopathy. Cell. 2019 Jul 25;178(3):521-535.e23.
4. A novel approach to reverse proteinopathies https://www.nature.com/articles/d41573-019-00133-5
5. Czerniecki SM, et al.High-Throughput ScreeningEnhancesKidneyOrganoid Differentiation from HumanPluripotent Stem Cells and Enables Automated Multidimensional Phenotyping. Cell Stem Cell. 2018 Jun 1;22(6):929-940.e4.
6. Machine learning brings cell imaging promises into focus
 
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来源:珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司
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