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细胞迁移与侵袭全攻略
点击次数:2013 发布日期:2019-7-3  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

 当需要进行细胞共培养、细胞趋化、细胞迁移以及细胞侵袭等研究的时候,需要在培养板上放入小室。小室内通称上室,培养板内则称下室,小室的底部有通透性的膜,一般常用聚碳酸酯膜(PC);根据实验需求选择不同孔径的聚碳酸酯膜, 并且经过不同处理,就可以进行上述的实验。因为聚碳酸酯膜具有通透性,下层培养液中的诱导性成分或是趋化因子,可以影响到上室内的细胞功能,不同厂家对小室的命名也不同,如Transwell、Boyden chamber、Millicell或是Thincert。
小室操作处理的步骤
Step1.选择水凝胶类型包被小室:
水凝胶主要分为两种:动物来源(如基质胶、胶原蛋白胶、纤维蛋白胶)或是合成型水凝胶(如Vitrogel 3DTM)。以24孔板的小室为例,取70-100μl(体积量不需太多,刚好将聚碳酸酯膜浸湿即可)稀释好的水凝胶,均匀涂抹在小室内的膜进行包被,37℃放置1-3 h左右(时间取决于选用的水凝胶类型)。
                                               ▲细胞迁移和侵袭实验图示
Step2.制备细胞悬液:
将进行实验的细胞消化下来,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1-2次,用不含血清培养基将细胞重悬,并进行细胞计数,调整细胞密度至5×104/ml -5×105/ml (根据实验决定细胞接种数量)。
Step3.接种细胞:
取100µl细胞悬液加入24孔板上层小室,24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基,避免下层培养液和小室间气泡产生,气泡会减弱下层培养液的趋化作用,如果不小心出现气泡,需要将小室提起,将气泡除去,再将小室放进培养板。
Step4.培养时间:
培养时间由实验目的决定,如细胞共培养、细胞趋化、细胞迁移以及细胞侵袭等多种方面的研究;细胞迁移与侵袭的能力,除了培养时间需要考虑外,也需考虑细胞的处理!
Step5.结果分析:
结束培养,取出小室,移除孔中培养液,用无钙镁的PBS洗2-3次,使用甲醇固定15-30分钟后,将小室适当风干。用预备好的0.1%-0.5%结晶紫染色,再用棉签轻轻擦掉内层未迁移细胞,用PBS洗3次。在200倍或400倍显微镜视野下,随机选择五个视野拍照观察并计数穿过膜后的细胞。
▲统计穿膜后细胞数量图示
Reference
Transwell® Invasion Assays. Methods Mol Biol. 2011; 769:97-110
 
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